Numune ön işleminin önemi
Numune ön işlemi, enstrümantal analizde (özellikle kromatografik analiz) zaman alıcı ve hataya açık bir adımdır. Numune işleminin kalitesi, kromatografik analizin nihai sonucunu doğrudan etkiler. Bu nedenle analiz ve tespit verimliliğinin artırılması amacıyla, kromatografik analize yönelik numune hazırlama yöntem ve tekniklerinin geliştirilmesi ve optimize edilmesi önemli bir konudur. Bazı numuneler proteinler, yağlar, karbonhidratlar, pigmentler vb. gibi bileşenleri içeren karmaşık matris sistemlerine ait olduğundan, karmaşık matris arka planı, analiz edilecek hedef bileşiklerin ekstraksiyonu, ayrılması, saflaştırılması ve belirlenmesinde büyük sorun yaratacaktır. Bu nedenle numune ön işlemi karmaşık ve zor olmasının yanı sıra analiz sonuçlarının doğruluğu, güvenilirliği ve hassasiyetinde de belirleyici bir role sahiptir.
Numune ön işlem süresi tüketiminin yüzdesi
LC/MS/MS son derece hassas cihazlar için uygun numune ön işlemi, matris girişimini azaltmak ve bileşenleri zenginleştirmek açısından çok önemlidir.
Numune ön işleminin prensipleri
Hazırlama sırasında bileşenlerde kimyasal değişikliklerden kaçının; önceden belirlenmiş bileşenlerin kirlenmesini önlemek ve önlemek; alakasız bileşiklerin hazırlama sürecine dahil edilmesini en aza indirgemek; ve mümkün olduğunca basit ve kolay hale getirin.
Numune ön işleminin amacı
Parçacıkları çıkarın; müdahale eden yabancı maddeleri azaltmak; eser bileşenleri konsantre edin; algılama hassasiyetini ve seçiciliğini geliştirin; ayırma etkisini iyileştirmek; kromatografik kolonları ve aletleri korumak; solvent değişimi.
Numune ön işleminin gelişim eğilimi
▶Ortak numune ön işlemi şunları içerir: Sindirim yöntemi: numunenin asit, oksidan, katalizör vb. ile bir geri akış cihazına veya kapalı bir cihaza yerleştirilmesi, ısıtılması ve organik maddenin ayrıştırılması ve yok edilmesi yöntemi. Islak sindirim yöntemi
1. Nitrik asit parçalama yöntemi (daha berrak sulu çözelti örnekleri için) 2. Nitrik asit-perklorik asit parçalama yöntemi (oksitlenmesi zor organik madde içeren numunelerin parçalanması) 3. Nitrik asit-sülfürik asit parçalama yöntemi (nitrik asit: sülfürik asit)=5:2, genellikle az miktarda hidrojen peroksit eklenir) 4. Sülfürik asit-fosforik asit sindirim yöntemi (Fe3+ iyonlarının girişimini ortadan kaldırmaya yardımcı olur) 5. Sülfürik asit-potasyum permanganat sindirim yöntemi (genellikle civanın sulu çözelti örneklerini belirlemek için kullanılır) 6. Nitrik asit-hidrojen peroksit sindirim yöntemi: Bazı insanlar bu yöntemi azot, fosfor, potasyum, bor, arsenik, flor ve diğer elementler 7. Çok bileşenli sindirim yöntemi: Üç veya daha fazla asit veya oksidanlı sindirim sistemi gereklidir. Kuru kül yöntemi (yüksek sıcaklıkta ayrıştırma yöntemi)
1. Kül yöntemi, numuneleri ayrıştırmak için az miktarda kimyasal reaktif kullanmaz veya kullanmaz ve daha büyük tartım numunelerini işleyebilir, dolayısıyla eser element belirleme doğruluğunun arttırılması faydalıdır. 2. Külleme sıcaklığı genellikle 450-550 derecedir; bu, uçucu bileşenler içeren numunelerin işlenmesi için uygun değildir ve külleme süresi de nispeten uzundur. 3. Numunenin cinsine ve ölçülecek bileşenlerin özelliklerine göre farklı potalar ve külleme sıcaklıkları seçilir. Yaygın olarak kullanılan potalar kuvars, platin, gümüş, nikel, demir, porselen, politetrafloroetilen ve diğer özelliklerdir. Prensip, potanın numuneyle reaksiyona girmemesi ve işleme sıcaklığında stabil olmasıdır. 4. Genellikle küllenen biyolojik numunelere başka hiçbir reaktif eklenmez, ancak ayrışmayı teşvik etmek ve belirli elementlerin buharlaşma kaybını önlemek için genellikle uygun miktarda yardımcı külleme maddesi eklenir. Numune tamamen kül edildikten sonra analiz ve tespit için seyreltik nitrik asit veya hidroklorik asit içerisinde çözülür.
Conventional pretreatment methods Extraction and enrichment 1. Extraction method 1. Oscillation extraction method (vegetables, fruits, grains) 2. Tissue crushing extraction (extracting organic pollutants from animal and plant tissues) 3. Soxhlet extraction (commonly used to extract organic pollutants such as pesticides, petroleum, phenylhydrazine and pyrene from biological and soil samples) 2. Volatilization and evaporation concentration The volatile separation method uses the high volatility of certain components or converts the components to be measured into volatile substances, and then uses inert gas to take them out to achieve the purpose of separation. Evaporation concentration refers to heating the water sample on a hot plate or in a water bath to slowly evaporate the water, so as to reduce the volume of the water sample and concentrate the components to be measured. 3. Distillation method uses the different boiling points of the components of the water sample to separate them from each other; when determining volatile phenols, cyanides, and fluorides in water samples, they must first be pre-distilled and separated in an acidic medium; distillation has three functions: digestion, enrichment, and separation. 4. Ion exchange method uses ion exchangers to exchange reactions with ions in the solution for separation. Ion exchangers can be divided into inorganic ion exchangers and organic ion exchangers (ion exchange resins). ㈤ Coprecipitation method: The phenomenon that a poorly soluble compound in a solution carries out certain coexisting trace components in the process of forming a precipitate. The principle of coprecipitation is based on surface adsorption, the formation of mixed crystals, the interaction and inclusion of heteroelectron nuclei colloidal substances, etc. 1. Coprecipitation separation using adsorption: Common carriers include Fe (OH) 3, Al (OH) 3, Mn (OH) 2 and sulfides, etc. 2. Coprecipitation separation using the formation of mixed crystals 3. Coprecipitation separation using organic coprecipitants ㈥ Adsorption method: Use porous solid adsorbents to adsorb one or several components in the water sample on the surface to achieve the purpose of separation. Commonly used adsorbents include activated carbon, alumina, molecular sieves, large mesh resins, etc. The polluted components adsorbed and enriched on the surface of the adsorbent can be desorbed by organic solvents or heated for determination. ㈦ Chromatography Chromatography is divided into column chromatography, thin layer chromatography, paper chromatography, etc., and adsorbents are divided into inorganic adsorbents and organic adsorbents. ㈧ Sulfonation and saponification Sulfonation: The interfering substances such as fats and waxes in the extract can undergo sulfonation reaction with concentrated sulfuric acid to generate highly polar sulfonic acid compounds, which are separated from the pesticides in the extract as the sulfuric acid layer separates. The sulfonation method uses the saponification reaction of oils and fats with strong alkali to generate fatty acid salts and separate them. ㈨ Low-temperature freezing method is based on the principle that the solubility of different substances in the same solvent varies with temperature to separate them from each other. ㈩ Principle of extraction: The distribution coefficient of substances in different solvent phases is different, so as to achieve the separation and enrichment of components. Types of conventional liquid-liquid extraction Extraction of organic substances: Organic substances separated in the aqueous phase are easily extracted by organic solvents Extraction of inorganic substances: First, a reagent is added to combine with the ionic components in the aqueous phase to generate a substance that is uncharged and easily soluble in organic solvents. The reagent, organic phase, and aqueous phase together form an extraction system. According to the different types of extractables generated, it can be divided into chelate extraction system, ion-association complex extraction system, ternary complex extraction system, and synergistic extraction system. Overview of solid phase extraction (SPE) It is developed by combining liquid-solid extraction and column liquid chromatography technology. SPE is a column chromatography separation process, which has many similarities with high performance liquid chromatography (HLPC) in terms of separation mechanism, stationary phase and solvent selection. The particle size of SPE filler (>40μm), HLPC'ninkinden (3-10μm) daha büyüktür. Bu nedenle SPE yalnızca çok farklı tutma özelliklerine sahip bileşikleri ayırmak için kullanılabilir. Düşük ayırma verimliliğine sahip SPE teknolojisi esas olarak numuneleri işlemek için kullanılır. SPE'nin amacı, sonraki analizlere müdahale eden maddeleri numuneden çıkarmaktır; eser bileşenleri zenginleştirin ve analitik hassasiyeti artırın; analitik yöntemle eşleşecek şekilde numune çözücüyü değiştirin; yerinde türevlendirme; numunenin tuzdan arındırılması; ve numunelerin saklanmasını ve taşınmasını kolaylaştırın. Kurulum SPE sütunu: Dolgu parçacık boyutu, HLPC sütun dolgusundan farklıdır ve geri kalanı aynıdır. En çok kullanılan C18 fazıdır. Bu tip dolgu maddesi oldukça hidrofobiktir ve çoğu organik maddenin sulu fazda tutulmasını sağlar; farklı seçicilik ve tutma özelliklerine sahip başka malzemeler de kullanılır. Aktif gruplara sahip veya aktif bileşiklerle kaplanmış SPE fazları, türevlendirme reaksiyonlarını analiz etmek için kullanılabilir. SPE diski: Membran filtrelere çok benzer. Disk çıkarıcı, dolgu maddesi içeren bir PTFE diski veya dolgu maddesi yüklü bir cam elyaf tabakasıdır; dolgu, toplam SPE diskinin yaklaşık %60 ila %90'ını oluşturur ve diskin kalınlığı yaklaşık 1 mm'dir. Öncekinden farkı yatak kalınlığı/çapı (L/d) oranıdır. Sudaki eser kirleticileri zenginleştirmek için uygundur. Katı Faz Mikro Ekstraksiyon (SPME) Çevrimdışı ve Çevrimiçi SPE Çevrimdışı SPE 1. SPE ve analiz bağımsız olarak gerçekleştirilir ve SPE yalnızca sonraki analiz için uygun numuneler sağlar. 2. Numune çözeltisi ile dolgu maddesi arasında yeterli temasın sağlanması için solvent akışı çok yüksek olmamalıdır. 3. Otomatik cihazlarla tamamlanabilir. Otomatik SPE cihazı bir sütun rafı, bir dalgıç pompa, bir sıvı deposu, bir boru hattı ve bir numune işlemcisinden oluşur. Çevrimiçi SPE aynı zamanda çevrimiçi saflaştırma ve zenginleştirme teknolojisi olarak da bilinir ve esas olarak HLPC analizinin oluşturulması için kullanılır. SPE yöntemi Sütun ön arıtma amacı: 1. Dolguda bulunabilecek yabancı maddeleri gidermek; 2. Dolguyu solventleştirin ve katı faz ekstraksiyonunun tekrarlanabilirliğini iyileştirin Numune ekleme 1. Analit kaybını önlemek için numune solvent konsantrasyonu çok yüksek olmamalıdır; 2. Ters faz mekaniği ile ekstraksiyon yapılırken solvent olarak su veya tampon kullanılır ve organik solvent miktarı %10'u (V/V) aşmaz; 3. Numune ekleme sırasında analit kaybının üstesinden gelmek için numuneyi seyreltmek, numune hacmini azaltmak, SPE kolonundaki dolgu maddesi miktarını artırmak ve analiti güçlü şekilde tutan adsorbanları seçmek için zayıf çözücüler kullanılabilir. Analitlerin elüsyonu ve toplanması (başka bir durum, analitlerin kolondan geçerken safsızlıkların tutulmasıdır) (Katı dispersiyon ortamı ile katı faz ekstraksiyonu) 1. Ters faz ekstraksiyon kolonları için temizleme solventi, uygun konsantrasyonda organik madde içeren su veya tampondur. çözücü; 2. Temizleme solventinin optimum konsantrasyonunu ve hacmini belirlemek için numuneyi SPE kolonuna ekleyin, SPE kolon yatağının hacminin 5 ila 10 katı ile temizleyin, atık sıvıyı sırayla toplayıp analiz edin ve elüsyon profilini elde edin Analit için temizleme solventinin miktarı. Temizleme solventinin gücünü arttırın ve farklı güçlerde analitin elüsyon profiline göre temizleme solventinin uygun gücünü ve hacmini belirleyin; 3. Elüsyon ve toplamanın amacı: analitin tamamen elüte edilmesi ve en küçük hacim fraksiyonunda toplanması, bu arada SPE kolonunda analitten daha güçlü bir şekilde tutulan mümkün olduğu kadar çok safsızlığın tutulması; 4. Analitin konsantrasyonunu arttırmak veya sonraki analizler için solvent özelliklerini ayarlamak için, toplanan analit fraksiyonu nitrojen ile üflenerek kurutulabilir ve daha sonra küçük hacimli bir solvent içerisinde çözülebilir. SPE Çevre Analizinin Uygulanması 1. Yüzey suyu gibi çevresel numunelerdeki analitlerin konsantrasyonu çok düşüktür ve analitin analizden önce zenginleştirilmesi gerekir. 2. Biyolojik sıvıların bileşimi karmaşıktır ve büyük miktarda protein içerir. Analizden önce numunenin proteini uzaklaştırmak için ön işleme tabi tutulması gerekir. İlaç analizi Klinik analiz Yiyecek ve içecek analizi Katı faz mikro ekstraksiyonu (SPME) Katı faz mikro ekstraksiyonu "numune alma, ekstraksiyon, konsantrasyon ve enjeksiyon"u birleştirir ve numune ön işleme teknolojisi için gaz kromatografisi veya yüksek performanslı sıvı kromatografisi ile birlikte kullanılabilir. Katı faz mikro ekstraksiyon teorisi Denge teorisi: Adsorpsiyon işlemi sırasında katı ve sıvı veya gaz fazı arasında bir adsorpsiyon dengesi kurulur. Belirli bir süre içerisinde kütle transfer sürecinin yavaş olması nedeniyle dengeye tam olarak ulaşılamaz. Kaplama malzemesi ekstraksiyonunun seçiciliği esas olarak kaplama malzemesinin performansına bağlıdır. Analitin benzer polariteye sahip bir katı faz tarafından kolayca ekstrakte edilmesi prensibine göre uygun bir SPE kaplaması seçilir. Katı faz kaplamalar için en yaygın olarak kullanılan maddeler polimetilsiloksan (PDMS) ve poliakrilattır (PA), her ikisi de gaz kromatografisi ve sıvı kromatografisi için kullanılabilir. İlki çoğunlukla uçucu bileşikler, polisiklik aromatik hidrokarbonlar ve aromatik hidrokarbonlar gibi polar olmayan bileşikler için kullanılırken, ikincisi çoğunlukla triazinler ve fenolik bileşikler gibi polar bileşikler için kullanılır. Katı faz katmanı kuvars elyaf üzerine bağlanmamış, bağlı veya kısmen çapraz bağlı biçimde kaplanabilir. Kaplamaya bazı polimerlerin eklenmesi, kaplamanın yüzey alanını artırabilir ve SPME'nin verimliliğini artırabilir. 1. Aromatik hidrokarbonlar ve uçucu bileşikler için kullanılan polidimetilsiloksan-divinilbenzen (PDMS-DVB). 2. Alkoller gibi polar bileşikler için kullanılan polietilen glikol-divinilbenzen (CW-DVB). 3. İyonize yüzey aktif maddeler için kullanılan polietilen glikol kalıp reçinesi (CW-TPR) 4. Su ve havadaki eser miktardaki kirleticileri analiz etmek için kullanılan, grafit karbon siyahı ile kaplanmış kuvars elyaf. 5. Karbon nanotüp ve titanyum dioksit nanotüp yöntemlerinin oluşturulması 1. Örnekleme koşullarının tutarlılığının sağlanması. 2. Numune almayı etkileyen faktörler arasında numune alma süresi, sıcaklık, lif derinliği vb. yer alır. 3. Yanıt değeri ile analitin başlangıç konsantrasyonu arasında doğrusal bir ilişki koruyun. Ekstraksiyonun adsorpsiyon izoterminin doğrusal aralığı içinde olması için numune konsantrasyonu çok yüksek olamaz ve numune hacmi çok küçük olamaz. 4. Numuneye elektrolitlerin eklenmesi, çözeltinin iyonik gücünü artırabilir, böylece analitin çözünürlüğünü azaltabilir ve ekstraksiyon verimliliğini artırabilir; Numunenin pH'ını değiştirmek, asidik ve alkali maddelerin ekstraksiyon hızı üzerinde daha büyük bir etkiye sahiptir. Not: Mikro ekstraksiyonda tuz eklemenin etkisi bazen geleneksel sıvı-sıvı ekstraksiyondan farklıdır ve deney koşullarının optimize edilmesi gerekir. 5. Karıştırmak ekstraksiyon süresini kısaltabilir. Mikrodalga ekstraksiyonu (MAE) Mikrodalga ekstraksiyonu kısa ekstraksiyon süresine, iyi seçiciliğe, yüksek geri kazanım oranına, düşük reaktif kullanımına, düşük kirliliğe sahiptir, suyu ekstraktan olarak kullanabilir ve numune hazırlama koşullarını otomatik olarak kontrol edebilir; daha az uygulamaya sahiptir ve şu anda polisiklik aromatik hidrokarbonların, pestisit kalıntılarının, organometalik bileşiklerin, bitkilerdeki aktif bileşenlerin, zararlı maddelerin, minerallerdeki metallerin, kandaki ilaçların ve biyolojik örneklerdeki pestisit kalıntılarının ekstraksiyonunda kullanılmaktadır. Mikrodalga ekstraksiyon yöntemlerinin prensipleri ve özellikleri Mikrodalgaları emer (su, etanol, asit, alkali ve tuzlar) Mikrodalga ekstraksiyonunun yüksek verimliliği: 1. Mikrodalgaların ayrılan maddeler üzerinde doğrudan etkisi; 2. Mikrodalga ekstraksiyonu için polar olmayan solventlere göre polar solventlerin kullanılması daha avantajlıdır; 3. Kapalı kapların kullanılması, mikrodalga ekstraksiyonunun çözücünün kaynama noktasından çok daha yüksek bir sıcaklıkta gerçekleştirilmesine olanak tanır ve mikrodalga ekstraksiyonunun verimliliğini önemli ölçüde artırır. Yansıtan mikrodalgalar (metalik maddeler) İletim mikrodalgaları (polar olmayan maddeler) Mikrodalga ekstraksiyonu ekipman ve yöntemler (ana bileşenler özel olarak üretilmiş mikrodalga ısıtma cihazları, ekstraksiyon kapları ve farklı gereksinimlere göre donatılmış basınç ve sıcaklık kontrol cihazlarıdır) Çok boşluklu 2450MHz: Aynı anda birden fazla numune hazırlanabilir, ekstraksiyon koşullarını kontrol etmek kolaydır ve ekstraksiyon hızlıdır. Geleneksel mikrodalga ekstraksiyon yöntemi: Ekstrakte edilen numunelerle polar solventleri veya polar solventler ile polar olmayan solventlerin bir karışımını karıştırın, bunları mikrodalga numune hazırlama kaplarına koyun ve kapalı durumda bir mikrodalga numune hazırlama sisteminde ısıtın. Çıkarılan bileşenlerin gereksinimlerine göre ekstraksiyon basıncını veya sıcaklığını ve süresini kontrol edin; Isıtmanın sonunda numune filtrelenir ve filtrat doğrudan ölçülür veya ilgili işlemden sonra ölçülür. Normal koşullar altında, mikrodalga ekstraksiyon ısıtma süresi yaklaşık 5 ila 10 dakikadır. Ekstraksiyon solventinin ve numunenin toplam hacmi, numune hazırlama kabının hacminin 1/3'ünü aşmayacaktır. Tek modlu odaklama 2450MHz: Basınç ve sıcaklık kontrolü gerekmez, numune hazırlama hacmi büyüktür, bir seferde yalnızca bir numune hazırlanabilir ve ekstraksiyon süresi uzundur. Süperkritik akışkan ekstraksiyonu (SCF)
Süperkritik akışkan (SCF), sıcaklığı ve basıncı kritik noktadan yüksek olan bir akışkandır. Kendine has özellikleri şunlardır: 1. Difüzyon katsayısı gazınkinden daha küçüktür, fakat sıvınınkinden bir kat daha yüksektir; 2. Viskozitesi gazınkine yakındır; 3. Yoğunluğu sıvınınkine benzer ve basınçtaki hafif bir değişiklik yoğunluğunda önemli bir değişikliğe yol açabilir; 4. Basınç veya sıcaklıktaki değişiklikler faz değişikliklerine yol açabilir. Temel prensip Süperkritik durumda, süperkritik akışkan ayrılacak madde ile temas ettirilir, böylece sırasıyla polarite, kaynama noktası ve bağıl moleküler kütle bileşenlerini seçici olarak çıkarabilir ve süperkritik akışkanın yoğunluğu ve dielektrik sabiti artar. Kapalı sistemin basıncının artmasıyla polarite artar. Farklı polaritelerdeki bileşenler, program güçlendirme kullanılarak adım adım çıkarılabilir. Süperkritik CO2'nin çözünürlüğü: 1. Lipofilik ve düşük kaynama noktalı bileşenler düşük basınçta (104kPa) ekstrakte edilebilir; 2. Bir bileşiğin polar grupları ne kadar fazlaysa, ekstrakte edilmesi o kadar zor olur; 3. Bileşiğin bağıl moleküler kütlesi ne kadar yüksek olursa, ekstraksiyonu da o kadar zor olur. Değiştirici CO2, polar olmayan bir çözücüdür ve CO2'deki çözünürlüğünü arttırmak için genellikle polar bir çözücü eklenir, dolayısıyla buna değiştirici denir. En sık kullanılanlar metanol, aseton, etanol, etil asetat vb.'dir. Değiştiricinin etkisi sınırlıdır. Süperkritik akışkanın çözünürlüğünü değiştirirken aynı zamanda ekstraksiyon sisteminin yakalama etkisini de zayıflatacak, bu da analitik belirlemeye müdahale edebilecek ortak ekstraktların artmasına neden olacaktır. Kullanılan değiştiricinin miktarı küçük olmalı, genellikle %5'i geçmemelidir. Süperkritik akışkan ekstraksiyon teknolojisinin uygulanması, doğal maddelerin ekstraksiyonunda büyük avantajlara sahiptir; Etkili bir analitik yöntem haline gelmek için GC, IR, MS, LC vb. ile birlikte kullanılabilir.
